中华绒螯蟹卵巢差减cDNA文库的构建

应用抑制性差减杂交技术构建中华绒螯蟹卵巢两个发育时期的差减cDNA文库。正向差减杂交以Ⅲ期卵巢为试验方、Ⅱ期卵巢为驱动方,反向差减杂交以Ⅱ期卵巢为试验方、Ⅲ期卵巢为驱动方;将所获差减cDNA片段克隆入质粒表达载体,转化大肠杆菌JM109。最后获得的正、反向差减文库分别含863、360个重组子。PCR扩增鉴定正、反向差减cDNA文库的插入片段平均大小分别为360和160bp,表明所构建的差减言语库适合进一步研究中华绒螯蟹卵巢发育相关基因。     

盐酸环丙沙星在中华绒螯蟹体内药物代谢动力学研究

应用反向高效液相色谱法对盐酸环丙沙星在中华绒螯蟹雄、雌蟹血淋巴与肌肉内的代谢规律进行了研究。肌肉注射给药后血淋巴中盐酸环丙沙星的浓度立即达到峰值 ,药物开始向肌肉等组织中运转 ,血药浓度在 1h内迅速下降 ,而肌肉中的浓度达到峰值 ;此后无论是血淋巴还是肌肉中的盐酸环丙沙星浓度均缓慢下降 ,到第 12 0h雌、雄蟹中盐酸环丙沙星的浓度均在 1μg·mL-1(g-1)以下 ,到 2 16h均不能检出。研究表明 :中华绒螯蟹血淋巴中盐酸环丙沙星的药物浓度可用一级吸收二室开放模型描述 ,雄、雌蟹的消除半衰期 (T1/ 2 β)分别为 40 .34± 1.48h和 2 2 .0 7±0 31h ;中华绒螯蟹的性别对盐酸环丙沙星在其体内的代谢有较大的影响。     

狭额绒螯蟹的幼体发育

在水温18—20℃、盐度18‰—20‰、光照度200～600Ix的条件下,狭颚绒鳌蟹幼体发育经5个溞状幼体和1个大眼幼体期。从幼体出膜到大眼幼体出现历时15d、到仔蟹出现需23d。狭颚绒鳌蟹和中华绒鳌蟹的第一期溞状幼体可从第2触角的外肢、腹部侧刺数加以区别;两大眼幼体可从额角形状、第2—4胸足指节、腹肢外肢刚毛数及尾节刚毛着生情况进行区分。     

P450 in wild animals as a biomarker of environmental impact

The impact of environmental pollution on selected animals was tested by monitoring the hepatic content of cytochromes P450 and their enzyme activities or by calculating TEQ values from the concentration of pollutants in the body. Fish-eating Stellars Sea Eagles, Haliaeetus pelagicus, found dead in the northern part of Hokkaido island accumulated high levels of PCBs and DDT and metabolites. The TEQ values calculated from the PCB concentration in the eagles were high enough to cause a significant toxic effect in other birds living in the same environment. Some of these birds were also contaminated with high concentrations of lead. Spotted seals, Phoca largha, captured along the coast-line of Hokkaido accumulated PCBs in their fat at about 100 million times the concentrations in the surface sea water. The levels of expressions of hepatic microsomal CYP 1A1and related enzyme activities in these seals showed good correlation to the levels of PCBs accumulated in the fat. The fresh water crabs, Eriocheir japonicus, were captured from three different rivers with various degrees of pollution. The P450 content and the related enzyme activities showed good correlation to TEQ values obtained from the concentrations of PCBs and PCDDs in the crabs from the rivers. The wild rodents, Clethrionomys rufocanus, were captured from urban, agricultural, and forest areas in Hokkaido. Those from the forest area had the lowest CYP content and related enzyme activities, comparable to those in laboratory-raised animals. Those from the urban areas, presumably contaminated with PAHs from fuel combustion, showed increased CYP 1A1 content and related enzyme activities. Those from the agricultural areas showed increased levels of CYP 1A1, 2B, 2E1. Rats treated with some of the agrochemicals used in the area resulted in a similar pattern of induction. It is concluded that P450 can be a useful biomarker for assessing the environmental impact of chemical pollutants on wild animals.     

中华绒螯蟹胚胎附着系统的结构和形成机制

利用透射电镜和扫描电镜技术研究了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)胚胎附着系统的结构及形成机制。中华绒螯蟹受精卵附着在雌性腹肢内肢的携卵刚毛上。该附着系统由三个连续部分组成:卵膜、卵柄和被膜,后者覆盖在携卵刚毛的绒毛上。研究结果显示:中华绒螯蟹的成熟胚胎由三层明显的卵膜组成,即E1、E2和E3层,但胚胎附着系统的卵柄及被膜仅为外层(E1)。卵巢中成熟卵的卵膜仅由E1层组成,E1分为两个亚层(E1a′、E1b′)。胚胎附着系统的形成与雌蟹的行为、腹肢粘液腺分泌的粘液、卵膜的超微结构及各层的变化有关。受精卵刚从生殖孔中排出时,卵膜(E1a′、E1b′)并不能直接粘附在携卵绒毛上。产卵后不久,雌蟹腹肢粘液腺分泌粘液的量增多,E1a′、E1b′的结构发生变化,表现为边界模糊,卵膜出现很强的粘性。在产卵后约60min E1层又明显分为两个亚层(E1a、E1b),同时排卵后雌蟹腹部的携卵绒毛不断地运动,这种运动促使携卵绒毛外的被膜形成。随着E1层亚结构的变化,E2层也开始形成,当E1新的两个亚层出现时,部分区域的E1层与E2层发生分离,卵柄开始形成,并牢固地附着在携卵绒毛上。被膜、卵柄与卵膜最外层的结构相同,均由E1层构成[动物学报51(5):852-861,2005]。     

中华绒螯蟹正常附着胚胎与流产胚胎的结构特点

用扫描电镜技术观察了中华绒螯蟹正常附着胚胎及流产胚胎的结构特点。结果表明,受精卵从生殖孔排出15min后,孵化室中的孵化液体积增大,使胚胎浸没在孵化液中,胚胎表面具有粘性;产卵后30min．卵柄初步形成;80～140min后卵柄完全形成,胚胎牢固地粘附在携卵绒毛上。正常胚胎的卵柄高度扭曲,上有很多毛状物,同时携卵刚毛上有很多粘液;流产胚胎的卵柄上无毛状物,但卵柄及胚胎表面有许多寄生物附着。携卵刚毛上的粘液及卵柄上的毛状物可能和胚胎附着有关;而胚胎表面寄生物的活动,可能使胚胎外被、卵柄以及卵索的结构发生变化,增加了胚胎之间的摩擦,进而胚胎呼吸困难,以致死亡和流产。     

中华绒螯蟹二株呼肠孤病毒的初步研究

在研究中华绒螯蟹病害的过程中 ,分离到两株呼肠孤病毒 (分别命名为EsRV816和EsRV90 5 )。EsRV816从江苏某养殖场分离 ,EsRV90 5从武汉某养殖场分离。EsRV816和EsRV90 5的病毒粒子为球状对称结构 ,大小分别为 6 5nm和 5 5nm。病毒粒子基因组分别为 10和 12个节段的双链RNA。根据它们的宿主范围、基因组节段数及电泳型 ,这两种病毒很可能属于呼肠孤病毒科的两个新属     

河蟹眼柄神经分泌细胞离子通道的膜片钳研究

采用全细胞膜片钳技术对培养12－24小时不同形态河蟹眼柄视节端髓X器官（MTXO）神经分泌细胞离子通道进行了研究。结果表明,河蟹眼柄MTXO中分布的A、B、C三种类型神经分泌细胞均可记录到由向电流和外向电流组成的正常全细胞电流。内向电流由高电压激活钙离子通道电流（Lca)和对TTX敏感钠离子通道电流（INa）组成。ICa的激活电压为－30mV,在0－ 20mV电压下达到峰值,在－40mV和－70mV保持电压下记录的ICa激活阈值、初始峰值及I－V曲线无明显差别。外向电流明显,幅值较大,包括对4－AP敏感的快速激活、快速失活钾离子通道电流（IA）和对TEA敏感的缓慢激活、缓慢失活钾离子通道电流（IK）。正常蟹种、二龄成蟹和早熟蟹种MTXO神经分泌细胞均表达电压门控钠、钾、钙离子通道,通道电流和电压特征无明显区别.     

育肥饲料中植物油混合替代鱼油对中华绒螯蟹雄体脂肪酸代谢相关基因表达的影响

为研究植物油替代鱼油对中华绒螯蟹(以下简称河蟹)脂肪酸代谢产生的影响, 通过荧光定量PCR (qRTPCR)技术研究了河蟹脂肪酸碳链延长酶(Es-FAE)、9脂肪酸去饱和酶(Es-FAD9)、6脂肪酸去饱和酶b (Es-FAD6b)、脂肪酸结合蛋白3 (Es-FABP3)、脂肪酸结合蛋白9 (Es-FABP9)和脂肪酸结合蛋白10 (Es-FABP10)基因在不同组织中的表达情况, 以及育肥饲料中不同鱼油替代水平(鱼油替代水平分别为0、25%、50%、75%和100%, 记为饲料1#5#组)对河蟹雄体肝胰腺中这些基因mRNA表达水平的影响, 以探讨育肥中鱼油替代对河蟹雄体成蟹脂肪酸代谢的影响。结果表明: (1) Es-FAE、Es-FAD6b和Es-FAD9均在肝胰腺中表达水平最高, 在心脏和血淋巴中表达水平较低, 不同基因在其他组织中的表达规律有所不同; Es-FABP3、Es-FABP9和Es-FABP10主要在肝胰腺、肌肉、输精管和副性腺中表达水平较高, 在胃、肠和心脏中表达水平较低。(2) 随着饲料中鱼油替代水平的提高, 肝胰腺中Es-FAE-mRNA有显著增加趋势; 就Es-FAD6b而言, 饲料3#组显著高于饲料2#组, 其余各组间差异不显著; 随着饲料中鱼油水平的降低, 饲料1#3#组肝胰腺中Es-FAD9-mRNA也有显著增加趋势, 但差异不显著。(3) 就Es-FABP3而言, 饲料2#和3#组肝胰腺中表达水平最高,且显著高于饲料1#组(P0.05), 其余各组间差异不显著; 随着鱼油替代水平的升高, 肝胰腺中Es-FABP9和Es-FABP10-mRNA水平均有先上升后下降趋势, 但各组间差异不显著。综上, 河蟹脂肪酸代谢和转运相关基因在肝胰腺中表达水平最高, 饲料中不同鱼油替代水平对肝胰腺中上述基因mRNA表达水平具有较大影响。     

水体盐度对中华绒螯蟹成体雄蟹渗透压调节和生理代谢的影响

为研究长期不同水体盐度对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis以下简称河蟹)成体雄蟹渗透压调节和生理代谢的影响, 在不同水体盐度条件下(0、6、12和18)对河蟹雄体进行为期60d的养殖实验, 并分别检测其渗透调节及生理代谢相关指标。结果显示: (1)血清渗透压、Na+、Mg2+和Cl-含量随水体盐度上升而显著上升(P0.05), K+和Ca2+含量有上升趋势, 但各盐度组差异不显著(P0.05); 无论何组雄蟹, 其血清渗透压均显著高于对应的水体渗透压; (2)0组雄蟹后鳃Na+/K+-ATP酶活性显著高于其他组(P0.05), 其他各组间差异不显著(P0.05); (3)就血清生理代谢指标而言, 12组雄蟹血清中甘油三酯(TG)含量显著高于其他组(P0.05), 而尿酸(UA)、葡萄糖(Glu)、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性相对较低; 所有组尿素(Urea)、碱性磷酸酶(ALP)含量差异不显著(P0.05); (4)就肝胰腺生理代谢指标而言, 6组肝胰腺MDA含量和-谷氨酰转肽酶(-GT)活力最低, 12组酸性磷酸酶(ACP)和-GT活性显著高于其他盐度组(P0.05)。因此, 适当提高水体盐度可提高河蟹成体雄蟹的血清渗透压及其主要离子含量, 同时降低其后鳃中Na+/K+-ATP酶活性。肝胰腺和血清代谢指标暗示12盐度组雄体的代谢水平相对较低, 具有较强的免疫性能和抗氧化能力。